Studii in vitro privind proprietățile antitumorale și
chemopreventive ale β-criptoxantinei, zeaxantinei și a
extractului lipofil de cătină (Hippophae rhamnoides L.)
în cancerul de sân
In vitro investigations of the anticancer and chemopreventive properties of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) lipophilic extract in breast cancer

Titlul proiectului: Studii in vitro privind proprietățile antitumorale și chemopreventive ale β-criptoxantinei, zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină (Hippophae rhamnoides L.) în cancerul de sân
Acronim: BREASTCAROTENOMICS
Codul proiectului: PN-III-P1-1.1-PD-2019-0846
Contract de finanțare UEFISCDI: PD nr. 208/2020

Project title: In vitro investigations of the anticancer and chemopreventive properties of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) lipophilic extract in breast cancer
Acronym:  BREASTCAROTENOMICS
Project code: PN-III-P1-1.1-PD-2019-0846
UEFISCDI financing agreement: PD nr. 208/2020

REZUMATUL PROIECTULUI
Cancerul de sân este o boală heterogenă, iar răspunsul la terapia convențională este în strânsă legătură cu statusul hormonal. Una dintre principalele limitări ale chimioterapiei convenționale utilizate în tratamentul cancerului de sân este reprezentată de eșecul sau răspunsul incomplet la terapie. Astfel identificarea unor terapii alternative pe bază de compuși naturali pentru a diminua toxicitatea exercitată de terapia convențională și pentru a preveni carcinogeneza reprezintă o nevoie urgentă.
Carotenoidele sunt considerațe agenți anticancerigeni puternici care posedă o serie de proprietăți precum: antioxidante, antiproliferative, proapoptotice și stimularea sistemului imun. Numeroase studii epidemiologice au corelat concentrațiile de carotenoizi din sânge (β-criptoxantina, α-caroten, β-caroten, licopen, luteină și zeaxantină) cu riscul de cancer de sân, însă rezultatele prezente rămân în continuare controversate. Drept urmare, acest studiu își propune să elucideze rolurile carotenoizilor reprezentați de către β-criptoxantină, zeaxantină și extract lipofil de cătină în mecanismele moleculare căilor de semnalizare în cancerul de sân.
Datorită sistemului lor polenic extins (legături duble conjugate), carotenoizii sunt susceptibili la degradare la temperaturi ridicate, lumină, pH acid și în prezența speciilor reactive de oxigen, ceea ce duce la formarea de izomeri geometrici, epoxizi sau apocarotenali. Au fost dezvoltate diverse preparate de cararotenoizi pentru a îmbunătăți stabilitatea, biodisponibilitatea sau eliberarea lor controlată, de exemplu lipozomi, complexe ciclodextrină și microemulsie și continuând cu nanostructuri recent dezvoltate precum nanoparticule cu lipide solide, transportori lipidici cu nanostructură, nanoemulsii și nanocapsule. Drept urmare, acest studiu își propune să evalueze eficacitatea carotenoizilor încapsulați în lipozomi asupra liniilor celulare (T47D, MCF-7, MDA-MB-231, BT549) de cancer de sân.

PROJECT SUMMARY 
Breast cancer is a heterogeneous disease and the response to conventional therapy is closely related to hormonal status. One of the main limitations of conventional chemotherapy used for breast cancer treatment is represented by the failure or incomplete response to therapy. Thus, the identification of alternative therapies based on natural compounds aiming to reduce the toxicity exerted by conventional therapy and to prevent carcinogenesis is an urgent need.
Carotenoids are considered powerful anticancer agents that possess a number of properties such as: antioxidants, antiproliferative, proapoptotic and immune system enhancement. Numerous epidemiological studies have correlated blood carotenoid concentrations (β-cryptoxanthin, α-carotene, β-carotene, lycopene, lutein and zeaxanthin) with breast cancer risk, but the results of present studies still remain controversial. As a result, this study aims to elucidate the roles of carotenoids represented by β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract in the molecular mechanisms of signaling pathways in breast cancer.
Due to their extended pollen system (double conjugated bonds), carotenoids are susceptible to degradation at high temperatures, light, acid pH and in the presence of reactive oxygen species, leading to the formation of geometric isomers, epoxides or apocarotenals. Various formulations of cararotenoids have been developed in order to improve their stability, bioavalialbility or controlled release, e.g. liposomes, cyclodextrin complexes and microemulsion and continuing with newly developed nanostructures such as solid-lipid nanoparticles, nanostructured lipid carriers, nanoemulsions and nanocapsules As a result, this study aims to evaluate the efficacy of liposome encapsulated carotenoids on breast cancer cell lines (T47D, MCF-7, MDA-MB-231, BT549).


OBIECTIVELE PRINCIPALE

• 1. Prepararea și caracterizarea cromatografică prin metoda HPLC-PDA a extractului lipofil de cătină (Hippopae rhamnoides L.)
• 2. Pregătirea lipozomilor de control și a lipozomilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină și o combinație de β-criptoxantină cu zeaxantină
• 3. Evaluarea activității antioxidante extracelulare prin metodele DPPH, ORAC, TEAC, FRAP, precum și a activității antioxidante intracelulare prin analiza ROS a β-criptoxantinei, zeaxantinei, extractului lipofil de cătină, precum și a lipozomurilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină și β-criptoxantină + zeaxantină
• 4. Studii in vitro de testare a proprietăților antiproliferative, chemopreventive și proapoptotice ale β-criptoxantinei, zeaxantinei și extractului lipofil de cătină
• 5. Analiza de tip microarray
• 6. Validarea datelor microarray prin testul qRT-PCR

MAIN OBJECTIVES 

• 1. Preparation and chromatographic characterization by HPLC-PDA  of the sea buckthorn (Hippopae rhamnoides L.) berries lipophilic extract
• 2. Preparation of the control liposomes and the liposomes encapsulated with β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic sea buckthorn extract and a combination of β-cryptoxanthin with zeaxanthin
• 3. Evaluation of the extracellular antioxidant activity (DPPH, ORAC, TEAC, FRAP) and intracellular antioxidant activity (ROS assay) of singular β-cryptoxanthin, zeaxanthin, sea buckthorn lipophilic extract, as well as encapsulated liposomes with β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic sea buckthorn extract and β-cryptoxanthin+zeaxanthin
• 4. In vitro studies testing the antiproliferative, chemopreventive and proapoptotic properties of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract
• 5. Microarray analysis
• 6. Validation of the microarray data through qRT-PCR assay

ACTIVITĂȚILE PRINCIPALE:

• A1.1 Izolarea carotenoizilor totali din fructele de cătină, folosind metanol: acetat de etil: eter de petrol (1:1:1, v/v/v), după o metodă validată anterior.
• A1.2 Caracterizarea cromatografică prin analiza HPLC-PDA a extractului lipofil de cătină
• A.2.1 Prepararea după o metodă validată anterior a lipozomilor de control, precum și a lipozomilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină și extract lipofil de cătină
• A.3.1 Capacitatea antioxidantă extracelulară a β-criptoxantinei, a zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină va fi evaluată spectrofotometric prin: capacitatea de inhibare a radicalului DPPH (2,2-difenil-1-picrililhidrazil), capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC), echivalentul Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC), potenţialul antioxidant manifestat prin reducerea ionului feric (FRAP) după metode validate anterior. Capacitatea antioxidantă intracelulară a β-criptoxantinei, a zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină va fi evaluată spectrofotometric prin determinarea cantitativă a speciilor reactive de oxigen intracelulare (ROS) după un protocol validat anterior.
• A.4.1 Creșterea liniilor celulare standardizate de cancer de sân T47D (carcinom ductal, subtip epitelial, ER+, PR+, HER2-), MCF-7 (adenocarcinom, subtip epitelial, ER+, PR+, HER2-), MDA-MB-231 (adenocarcinom, subtip mezenchimal ER-, PR-, HER2-) și BT549 (carcinom ductal, subtip mezenchimal, ER-, PR-, HER2-) (ECACC) în condiții și medii de cultură specifice.
• A.4.2 Evaluarea citotoxicității β-criptoxantinei, zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină prin testul de viabilitate celulară (MTT) administrat în tratament singular.
• A.4.3 Evaluarea potențialului efect sinergic și chemopreventiv cu ajutorul testului MTT folosind un tratament combinat (β-criptoxantină + zeaxantină, β-criptoxantină + doxorubicină, β-criptoxantină + taxotere, zeaxantină + doxorubicină, zeaxantină + taxotere, extract de cătină + doxorubicină, extract de cătină + taxotere)
• A.4.4 Evalua eficacității carotenoizilor β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină și β-criptoxantină + zeaxantină încapsulați în lipozomi comparativ cu liniile celulare tratate cu lipozomii martor cu ajutorul testul MTT
• A.4.5 Evaluarea ratei de apoptoză prin marcarea cu Anexină V-FITC și iodură de propidiu și sortarea celulelor apoptotice într-un citometru de flux S3e Cell Sorter (Bio-Rad) la tratamentele singulare (β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină) și combinatorii (β-criptoxantină + zeaxantină, β-criptoxantină + doxorubicină, β-criptoxantină + taxotere, zeaxantină + doxorubicină, zeaxantină + taxotere, extract de cătină + doxorubicină, extract de cătină + taxotere)
• A.5.1 Sinteza sondelor de microarray marcate cu cianina 3 (ARNC-Cy3) și hibridizarea acestora pe lame de tipul 3v14944 k Whole Human Genome Oligo Microarray conform protocoalelor furnizate de către Agilent Technologies
• A.5.2 Scanarea lamelor de microarray cu ajutorul scaner-ului Agilent Technologies G2505B US45102867, urmată de procesarea imaginilor cu software-ul Feature Extraction v. 10.5.3 (Agilent Technologies) și analiza datelor cu ajutorul software-ul GeneSpring
• A.6.1 Pentru realizarea testului de real time PCR cantitativ (qRT-PCR) se va face sinteza de ADN complementar (ADNc) cu ajutorul kit-ul de sinteză First Strand cDNA synthesis kit conform recomandărilor producătorului (Hoffmann-La Roche, Basel, Elveția), iar amplificarea probelor de ADNc se va realiza în aparatul Light Cycler 480 (Roche) cu ajutorul primerilor specifici și a sondelor de fluorescență de tip Taqman utilizând kit-ul Light Cycler Taqman Master Kit (Hoffmann-LaRoche, Basel, Elveţia). Toate probele vor fi normalizate la gena housekeeping 18S, iar nivelurile de expresie relative ale genelor de interes vor fi calculate folosind metoda ΔΔCt. Analiza statistică a genelor diferit exprimate

MAIN ACTIVITIES: 

• A1.1 Isolation of total carotenoids from sea buckthorn fruits, using methanol: ethyl acetate: petroleum ether (1: 1: 1, v / v / v), according to a previously validated method.  
•  A1.2 Chromatographic characterization by HPLC-PDA analysis of sea buckthorn lipophilic extract   
•  A.2.1 Preparation by a previously validated method of control liposomes as well as liposomes encapsulated with β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract   
• A.3.1 The extracellular antioxidant capacity of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn extract will be evaluated spectrophotometrically by: the ability to inhibit the DPPH radical (2,2-diphenyl-1-picrylylhydrazyl), the ability to absorb the oxygen radical ( ORAC), the Trolox equivalent of antioxidant capacity (TEAC), the antioxidant potential manifested by the reduction of ferric ion (FRAP) according to previously validated methods. The intracellular antioxidant capacity of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract will be evaluated spectrophotometrically by quantitative determination of intracellular reactive oxygen species (ROS) according to a previously validated protocol.    
• A.4.1 Growth of standardized T47D breast cancer cell lines (ductal carcinoma, epithelial subtype, ER +, PR +, HER2-), MCF-7 (adenocarcinoma, epithelial subtype, ER +, PR +, HER2-), MDA-MB-231 ( adenocarcinoma, mesenchymal subtype ER-, PR-, HER2-) and BT549 (ductal carcinoma, mesenchymal subtype, ER-, PR-, HER2-) (ECACC) under specific culture conditions and media.   
•  A.4.2 Assessment of cytotoxicity of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract by single cell viability test (MTT).  
•  A.4.3 Evaluation of the potential synergistic and chemopreventive effect using the MTT test using a combination treatment (β-cryptoxanthin + zeaxanthin, β-cryptoxanthin + doxorubicin, β-cryptoxanthin + taxotere, zeaxanthin + doxorubicin + taxanex, zeaxantx extract sea buckthorn extract + taxotere)   
•  A.4.4 Evaluate the efficacy of carotenoids β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic extract of sea buckthorn and β-cryptoxanthin + zeaxanthin encapsulated in liposomes compared to cell lines treated with control liposomes using MTT test    
• A.4.5 Evaluation of apoptosis rate by labeling with Annexin V-FITC and propidium iodide and sorting of apoptotic cells in an S3e Cell Sorter (Bio-Rad) flow cytometer for single treatments (β-cryptoxanthin, zeaxanthin, sea buckthorn extract ) and combinators (β-cryptoxanthin + zeaxanthin, β-cryptoxanthin + doxorubicin, β-cryptoxanthin + taxotere, zeaxanthin + doxorubicin, zeaxanthin + taxotere, sea buckthorn extract + doxorubicin, sea buckthorn extract + taxotere)    
• A.5.1 Synthesis of cyanine 3-labeled microarray probes (ARNC-Cy3) and hybridization to 3v14944 k Whole Human Genome Oligo Microarray slides according to protocols provided by Agilent Technologies    
• A.5.2 Scanning microarray slides using Agilent Technologies G2505B scanner US45102867, followed by image processing with Feature Extraction v. 10.5.3 (Agilent Technologies) software and data analysis using GeneSpring software  
• A.6.1 To perform the quantitative real-time PCR (qRT-PCR) test, complementary DNA (cDNA) synthesis will be performed using the First Strand cDNA synthesis kit according to the manufacturer's recommendations (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland ), and the amplification of the cDNA samples will be performed in the Light Cycler 480 (Roche) with the help of specific primers and Taqman type fluorescence probes using the Light Cycler Taqman Master Kit (Hoffmann-LaRoche, Basel, Switzerland). All samples will be normalized to the 18S housekeeping gene, and the relative expression levels of the genes of interest will be calculated using the ΔΔCt method. Statistical analysis of differently expressed genes 

REZULTATE ETAPA 1 - Prepararea și caracterizarea cromatografică prin metoda HPLC-PDA a extractului lipofil de cătină (Hippopae rhamnoides L.)
RESULTS OF STAGE 1 - Preparation and chromatographic characterization by HPLC-PDA method of sea buckthorn lipophilic extract (Hippopae rhamnoides L.) 

A.1.1 Izolarea carotenoizilor totali din fructele de cătină, folosind metanol: acetat de etil: eter de petrol (1:1:1, v/v/v), după o metodă validată anterior.
A.1.1 Isolation of total carotenoids from sea buckthorn fruits using methanol: ethyl acetate: petroleum ether (1: 1: 1, v / v / v), according to a previously validated method. 

Carotenoidele totale au fost determinate prin metoda spectrofotometricǎ. Randamentul optim de extracție a carotenoidelor a fost obținut prin utilizarea amestecului eter de petrol:acetat de etil:metanol, cu o cantitate totalǎ de 75.6 mg carotenoide/100 SU (Fig.1). Valoarea obținutǎ se ȋncadreazǎ ȋn valorile raportate pentru cultivări de cǎtinǎ din România: 29 – 151 mg/100 SU.

Total carotenoids were determined by the spectrophotometric method. The optimal extraction yield of carotenoids was obtained by using the mixture of petroleum ether: ethyl acetate: methanol, with a total amount of 75.6 mg carotenoids / 100 DS (dry substance) (Fig.1). The value obtained is within the reported values for sea buckthorn cultivars in Romania: 29 - 151 mg / 100 DS.    Fig.1. Dozarea carotenoidelor totale utilizând trei sisteme de solvenți/Total carotenoid dosing using three solvent systems

A1.2 Caracterizarea cromatografică prin analiza HPLC-PDA a extractului lipofil de cătină.
A1.2 Chromatographic characterization by HPLC-PDA analysis of sea buckthorn lipophilic extract. 

Extractele de cǎtinǎ au fost analizate atât sub forma nativǎ cât şi sub forma saponificatǎ, pentru a evidenția diferențele dintre cele douǎ metode de prelucrare a extractelor. Pigmenții carotenoidici majori din extractul nesaponificat din fructele de cǎtinǎ sunt reprezentați de esterii zeaxantinei cu diverşi acizi graşi, esterii luteinei şi ai β-criptoxantinei (Fig.2). În cantitǎți mai mici sunt prezenți şi alți esteri. Dintre hidrocarburi, ȋn cantitǎți mai mari se gǎseşte β-carotina, ȋn timp ce α-carotina, γ-carotina şi licopina se gǎsesc ȋn cantități mult mai mici (Tabel 1). Datoritǎ faptului cǎ spectrele de absorbție ale esterilor de carotenoide sunt identice cu cele ale carotenoidelor corespunzǎtoare libere, identificarea cu acuratețe a esterilor xantofilelor este posibilǎ doar prin spectrometrie de masǎ. Pentru identificarea carotenoidelor, extractul nativ a fost saponificat, prin tratarea cu KOH. Cromatograma HPLC a extractului saponificat evidențiazǎ procentajul ridicat de zeaxantinǎ, luteinǎ şi β-criptoxantinǎ. β-carotina este prezentǎ ȋn cantitǎți destul de mici (Fig. 3, Tabel 2). Acest profil este tipic soiurilor româneşti de cǎtinǎ, ȋn timp ce cǎtina originarǎ din Rusia sau Finlanda are un conținut mai ridicat de beta-carotinǎ şi, respectiv, mai scǎzut de zeaxantinǎ.

Sea buckthorn extracts were analyzed both in native and saponified form, to highlight the differences between the two methods of processing extracts. The major carotenoid pigments in the unsaponified extract of sea buckthorn fruits are represented by esters of zeaxanthin with various fatty acids, esters of lutein and β-cryptoxanthin (Fig.2). Other esters are present in smaller quantities. Among hydrocarbons, β-carotene is found in larger quantities, while α-carotene, γ-carotene and lycopine are found in much smaller quantities (Table 1). Due to the fact that the absorption spectra of carotenoid esters are identical to those of the corresponding free carotenoids, the accurate identification of xanthophyll esters is only possible by mass spectrometry. To identify carotenoids, the native extract was saponified by treatment with KOH. The HPLC chromatogram of the saponified extract shows a high percentage of zeaxanthin, lutein and β-cryptoxanthin. β-carotene is present in relatively small amounts (Fig. 3, Table 2). This profile is typical of Romanian sea buckthorn varieties, while sea buckthorn originating in Russia or Finland has a higher beta-carotene content and, respectively, a lower content of zeaxanthin.

                                        Tabel 2. Conținutul ȋn carotenoide majore ȋn extractul saponificat
                                        Table2. Content of major carotenoids in saponified extract


Tabel 1. Compoziția ȋn carotenoide a extractelor din fructele de cǎtinǎ (% din total carotenoide identificate)
Table 1 Carotenoid composition of sea buckthorn fruit extracts (% of total carotenoids identified)






























REZULTATE ETAPA 2 O2. Prepararea lipozomilor de control și a lipozomilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină și a unei combinații de β-criptoxantină cu zeaxantină. O3. Evaluarea activității antioxidante extracelulare prin metodele DPPH, ORAC, TEAC, FRAP și a activității antioxidante intracelulare prin analiza ROS a β-criptoxantinei, zeaxantinei, și a extractului lipofil de cătină, precum și a lipozomurilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină , extract lipofil de cătină și o combinație de β-criptoxantină cu zeaxantină. O4. Studii in vitro care testează proprietățile antiproliferative, chemopreventive și proapoptotice ale β-criptoxantinei, zeaxantinei și extractului lipofil de cătină

RESULTS OF STAGE 2 O2. Preparation of control liposomes and liposomes encapsulated with β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic sea buckthorn extract and a combination of β-cryptoxanthin with zeaxanthin. O3. Evaluation of extracellular antioxidant activity by DPPH, ORAC, TEAC, FRAP methods and intracellular antioxidant activity by ROS analysis of β-cryptoxanthin, zeaxanthin, and sea buckthorn lipophilic extract, as well as liposomes encapsulated with β-cryptoxanthin, zeaxanthin extract sea buckthorn and a combination of β-cryptoxanthin with zeaxanthin. O4. In vitro studies testing the antiproliferative, chemopreventive and proapoptotic properties of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract 

A.2.1 Prepararea după o metodă validată anterior a lipozomilor de control, precum și a lipozomilor încapsulați cu β-criptoxantină, zeaxantină și extract lipofil de cătină

A.2.1 Preparation by a previously validated method of control liposomes as well as liposomes encapsulated with β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract 

Pentru prepararea lipozomilor s-a utilizat o metoda adaptată și modificată după Pintea și colab. 2005 și Eichler și colab, 2002. Cantitățile de carotenoide au fost calculate astfel încât concentrația finală în suspensia de lipozomi să fie de 50 µM, iar raportul carotenoide/lipide să fie de 1 mol %. Carotenoidele (1.42 mg Zeaxantina; 0.9 mg beta-criptoxantina) au fost dizolvate în aproximativ 5 mL CH₂Cl₂. (diclorometan). La această soluție s-a adăugat L-α-fosfatidilcolină (Sigma Aldrich), în cantitate de 190 mg (pentru suspensia cu zeaxantina) și 123.6 mg (pentru suspensia cu beta-criptoxantina). Solventul a fost evaporat complet utlizând un rotaevaporator iar filmul obținut a fost uscat prin expunerea la un curent de azot. Pentru obținerea suspensiei primare peste filmul de lipide s-a adăugat mediul de cultură RPMI-1640 (50 mL pentru zeaxantina, 32 mL pentru beta-criptoxantina), iar baloanele au fost menținute într-o baie de ultrasunete (Elma Sonics) pentru 30 de minute. Ulterior, pentru omogenizarea probelor și pentru obținerea suspensiei de lipozomi unilamelari, probele au fost sonicate cu ajutor unei sonde de sonicare (Vibra Cell, Sonics), timp de 2 minute, în puls, la o amplitudine de 75%, evitând supraîncălzirea. Suspensia obținută a avut un aspect omogen și a fost filtrată prin filtre de 0.22 micrometri înainte de a fi adăugate culturii celulare.

An adapted and modified method according to Pintea et al was used to prepare the liposomes. 2005 and Eichler et al., 2002. Carotenoid amounts were calculated at final concentration of 50 µM in the liposome suspension and the carotenoid / lipid ratio was 1 mol%. The carotenoids (1.42 mg Zeaxanthin; 0.9 mg beta-cryptoxanthin) were dissolved in about 5 mL CH₂Cl₂. (dichloromethane). To this solution was added L-α-phosphatidylcholine (Sigma Aldrich), in an amount of 190 mg (for the suspension with zeaxanthin) and 123.6 mg (for the suspension with beta-cryptoxanthin). The solvent was completely evaporated using a rotary evaporator and the film obtained was dried by exposure to a stream of nitrogen. RPMI-1640 culture medium (50 mL for zeaxanthin, 32 mL for beta-cryptoxanthin) was added to the primary suspension over the lipid film, and the flasks were kept in an ultrasound bath (Elma Sonics) for 30 minutes. Subsequently, to homogenize the samples and to obtain the suspension of unilamellar liposomes, the samples were sonicated with the help of a sonication probe (Vibra Cell, Sonics), for 2 minutes, in pulse, at an amplitude of 75%, avoiding overheating. The resulting suspension had a homogeneous appearance and was filtered through 0.22 micrometer filters before being added to the cell culture.

A.3.1 Capacitatea antioxidantă extracelulară a β-criptoxantinei, a zeaxantinei și a extractului lipofil
de cătină a fost evaluată spectrofotometric prin: capacitatea de inhibare a radicalului DPPH
(2,2-difenil-1-picrililhidrazil), capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC), echivalentul Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC), potenţialul antioxidant manifestat prin reducerea ionului feric (FRAP) după metode validate anterior. Capacitatea antioxidantă intracelulară a β-criptoxantinei, a zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină va fi evaluată spectrofotometric prin determinarea cantitativă a speciilor reactive de oxigen intracelulare (ROS) după un protocol validat anterior.

A.3.1 Extracellular antioxidant capacity of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and lipophilic extract of sea buckthorn was evaluated spectrophotometrically by: the ability to inhibit the DPPH radical (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), oxygen radical uptake capacity (ORAC), Trolox equivalent of antioxidant capacity (TEAC), antioxidant potential evaluated by reduction of ferric ion (FRAP) according to previously validated methods. The intracellular antioxidant capacity of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract will be evaluated spectrophotometrically by quantitative determination of intracellular reactive oxygen species (ROS) according to a previously validated protocol. 

Tabelul 3. Potențialul antioxidant al extractului, exprimat în % de inhibiție a radicalilor liberi și în conținutul de tocoferoli, respectiv de acid ascorbic:
Table 3. The antioxidant potential of the extract, expressed as% of inhibition of free radicals and in the content of tocopherols and ascorbic acid, respectively:

Testele de evaluare a capacității antioxidante intracelulare au relevat faptul că extractul lipofil de cătină bogat în carotenoide a acționat ca antioxidant la concentrații mai mari (10-15 µM) în toate liniile celulare de cancer de sân testate, în timp ce zeaxantina și β-criptoxantina (50-100 µM) au crescut semnificativ procentele speciilor reactive de oxigen (ROS) numai în cadrul liniilor celulare T47D și BT-549 în absența condițiilor de stres oxidativ. În plus, procentele de ROS în condiții de stres oxidativ au fost ușor reduse de tratamentul cu extract lipofil de cătină (1-15 µM), respectiv cu zeaxantină (1-50 µM) și cu β-criptoxantina (1-10 µM). După tratamentul cu H2O2, s-a observat un efect pro-oxidant prin adăugarea a 20 µM de extract de cătină, respectiv 100 µM zeaxantină și β-criptoxantină în toate cele patru linii celulare de cancer de sân. Aceste rezultate sugerează că activitatea anti/pro-oxidantă a carotenoidelor depinde de fenotipul fiecărei linii celulare, de concentrația compușilor din extract, precum și de durata tratamentului (Fig.4).

The intracellular antioxidant capacity evaluation tests revealed that the carotenoid-rich sea buckthorn lipophilic extract acted as an antioxidant at higher concentrations (10-15 µM) in all breast cancer cell lines tested, while zeaxanthin and β-cryptoxanthin (50-100 µM) significantly increased specific percentages of reactive oxygen species (ROS) only within T47D and BT-549 cell lines in the absence of oxidative stress conditions. In addition, the percentages of ROS under oxidative stress conditions were slightly reduced by treatment with lipophilic sea buckthorn extract (1-15 µM), respectively with zeaxanthin (1-50 µM) and β-cryptoxanthin (1-10 µM). After H2O2 treatment, a pro-oxidant effect was observed by the addition of 20 µM sea buckthorn extract, respectively 100 µM zeaxanthin and β-cryptoxanthin in all four breast cancer cell lines. These results suggest that the anti/pro-oxidant activity of carotenoids depends on the phenotype of each cell line, the concentration of the compounds in the extract, as well as the duration of treatment (Fig. 4).

Fig.4 Efectul extracului lipofil de cătină (a), zeaxantinei (b) și al β- criptoxantinei (c) asupra producției și acumulării ROS în fiecare linie celulară standardizată de cancer de sân la 24 de ore. Pentru fiecare linie celulară, procentul ROS a fost calculat în raport cu controlul.
Effect of lipophilic sea buckthorn extract (a), zeaxanthin (b) and β-cryptoxanthin (c) on ROS production and accumulation in each standardized breast cancer cell line at 24 h. For each cell line, the percentage of ROS was calculated relative to the control.

A.4.1 Creșterea liniilor celulare standardizate de cancer de sân T47D (carcinom ductal, subtip epitelial, ER+, PR+, HER2-), MCF-7 (adenocarcinom, subtip epitelial, ER+, PR+, HER2-), MDA-MB-231 (adenocarcinom, subtip mezenchimal ER-, PR-, HER2-) și BT549 (carcinom ductal, subtip mezenchimal, ER-, PR-, HER2-) (ECACC) în condiții și medii de cultură specifice.

A.4.1 Growth of standardized T47D breast cancer cell lines (ductal carcinoma, epithelial subtype, ER +, PR +, HER2-), MCF-7 (adenocarcinoma, epithelial subtype, ER +, PR +, HER2-), MDA-MB-231 ( adenocarcinoma, mesenchymal subtype ER-, PR-, HER2-) and BT549 (ductal carcinoma, mesenchymal subtype, ER-, PR-, HER2-) (ECACC) under specific culture conditions and media. 

Celulele au fost crescute în mediul de cultură RPMI 1640 (liniile celulare T47D, MDA-231 și BT549), respectiv DMEM 4500 (linia celulară MCF-7), suplimentat cu 10% ser fetal bovin, glutamină 1% si penicilină-streptomicină 1%, la 37°C într-un incubator cu CO2 5%. Suplimentar la mediul de cultură s-a adăugat 0,023% insulină pentru linia celulară BT549, respectiv 0,2% insulină pentru linia celulară T47D. Toți reactivii necesari culturilor celulare s-au achiziționat de la firma Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Compușii standardizați de β-criptoxantină și zeaxantină s-au achiziționat de la firma Extrasynthese (Lyon, Franța).

Cells were grown in RPMI 1640 culture medium (T47D, MDA-231 and BT549 cell lines) and DMEM 4500 (MCF-7 cell line), respectively, supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% glutamine and 1% penicillin-streptomycin. , at 37°C in a 5% CO2 incubator. Supplementary, 0.023% insulin for the BT549 cell line and 0.2% insulin for the T47D cell line were added to the culture medium. All reagents needed for cell cultures were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The standardized compounds of β-cryptoxanthin and zeaxanthin were purchased from Extrasynthese (Lyon, France).

A.4.2 Evaluarea citotoxicității β-criptoxantinei, zeaxantinei și a extractului lipofil de cătină prin testul de viabilitate celulară (MTT) administrat în tratament singular.
A.4.2 Assessment of β-cryptoxanthin, zeaxanthin and sea buckthorn lipophilic extract cytotoxicity by single cell viability test (MTT). 

Testele de viabilitate celulară în vederea stabilirii dozei IC50 au identificat valori aproximativ asemănătoare cu o medie de 82,09 µM pentru tratamentul cu Zeaxantină în cadrul liniilor celulare T47D, MCF-7, MDA-231 și BT-549. S-a observat că linia celulară BT-549 este mai sensibilă la tratamentul cu Zeaxantină (IC50=79.14 µM), în timp ce linia celulară MCF-7 este mai rezistentă la acest tratament (IC50=87.57 µM). Tratamentul cu β-criptoxantină s-a dovedit a fi mai eficient pentru liniile celulare T47D (IC50=55.35 µM) și BT-549 (IC50=34.33 µM) deoarece au fost necesare concentrații mai mici de Beta-criptoxantină pentru inhibarea viabilității celulare cu 50%. Cele mai rezistente linii celulare la tratamentul cu Beta-criptoxantină s-au dovedit a fi MCF-7 (IC50=88.41 µM) și MDA-231 (IC50=113 µM) la care concentrațiile de IC50 au fost mai mari comparativ cu IC50 identificat la tratamentul cu Zeaxantină. Datorită conținutului bogat în mai multe tipuri de carotenoide majore precum zeaxantina, β-criptoxantina, luteina, α-crotina, β-carotina, dar și a altor compuși bioactivi importanți precum flavonoidele, acizi fenolici, α-tocoferolul, extractul lipofil de cătină s-a dovedit a fi cel mai eficient comparativ cu tratamentele singulare de carotenoide standardizate. Astfel linia celulară BT-549 s-a dovedit a fi cea mai sensibilă la tratament (IC50=12.62 µM), în timp ce linia celulară MDA-231 este cea mai rezistentă (IC50=32.03 µM), ambele linii aparținând subtipului molecular triplu negativ, considerat a fi unul dintre cele mai agresive tipuri de cancere de sân (Fig. 5, Tabelul 4).

According to cell viability tests in order to determine the IC50 dose, were identified approximately similar values with an average of 82.09 µM for zeaxanthin treatment in the T47D, MCF-7, MDA-231 and BT-549 cell lines. BT-549 cell line was found to be more sensitive to zeaxanthin treatment (IC50 = 79.14 µM), while MCF-7 cell line is more resistant to this treatment (IC50 = 87.57 µM). Β-Cryptoxanthin treatment proved to be more effective for T47D (IC50 = 55.35 µM) and BT-549 (IC50 = 34.33 µM) cell lines because lower concentrations of Beta-cryptoxanthin were required to inhibit cell viability by 50%. The most resistant cell lines to Beta-cryptoxanthin treatment were found to be MCF-7 (IC50 = 88.41 µM) and MDA-231 (IC50 = 113 µM) at which IC50 concentrations were higher compared to the IC50 identified in Zeaxanthin treatment. Due to its rich content in several major carotenoids such as zeaxanthin, β-cryptoxanthin, lutein, α-crotin, β-carotene, but also other important bioactive compounds such as flavonoids, phenolic acids, α-tocopherol, lipophilic extract of cat to be the most effective compared to single standardized carotenoid treatments. Thus the BT-549 cell line proved to be the most sensitive to treatment (IC50 = 12.62 µM), while the MDA-231 cell line is the most resistant (IC50 = 32.03 µM), both lines belonging to the triple negative molecular subtype, considered being one of the most aggressive types of breast cancer (Fig. 5, Table 4).

Tabelul 4. Citotoxicitatea tratamentului singular de Zeaxantină. Beta-criptoxantină și extract lipofil de cătină asupra celor patru linii celulare standardizate de cancer de sân
Table 4 Cytotoxicity of single Zeaxanthin treatment. Beta-cryptoxanthin and sea buckthorn lipophilic extract on the four standardized breast cancer cell lines



Fig.5 Efectele Zeaxantinei, Beta-criptoxantinei și a extractului lipofil de cătină administrate în tratament singular asupra celor patru linii celulare standardizate de cancer de sân
Effects of Zeaxanthin, Beta-Cryptoxanthin and Sea Buckthorn Extract in Single Treatment on the four standardized Breast Cancer Cell Lines


A.4.3 Evaluarea potențialului efect sinergic și chemopreventiv cu ajutorul testului MTT folosind un tratament combinat (β-criptoxantină + zeaxantină, β-criptoxantină + doxorubicină, β-criptoxantină + taxotere, zeaxantină + doxorubicină, zeaxantină + taxotere, extract de cătină + doxorubicină, extract de cătină + taxotere)

A.4.3 Evaluation of the potential synergistic and chemopreventive effect using the MTT test in a combinatorial treatment (β-cryptoxanthin + zeaxanthin, β-cryptoxanthin + doxorubicin, β-cryptoxanthin + taxotere, zeaxanthin + doxorubicin, zeaxanthin + taxotere, lipophilic sea buckthorn extract + doxorubicin, lipophilic sea buckthorn extract + taxotere) 

În urma efectuării testului de citotoxicitate pentru tratamentul combinat de zeaxantină și β-criptoxantină în vederea identificării unui potențial efect sinergic al acestor două carotenoide s-au obținut următoarele valori IC50: 211 µM (T47D), 54.12 µM (MCF-7), 93.39 µM (MDA-231) și 225.9 µM (BT-549) (Fig. 6, Tabelul 5). Valorile IC50 la tratamentul combinat de zeaxantină și beta-criptoxantină au fost mai mari decât concentrațiile de IC50 administrate la tratamentele singulare pentru liniile celulare, T47D, MDA-231 și BT-549, excepție făcând linia celulară MCF-7 la care tratamentul combinat al acestor două carotenoide s-a dovedit a fi mai eficient, iar concentrația IC50 identificată a fost mai mică în comparație cu IC50 identificate la tratamentele singulare.

Following the cytotoxicity test for the combined treatment of zeaxanthin and β-cryptoxanthin in order to identify a potential synergistic effect of these two carotenoids, the following IC50 values were obtained: 211 µM (T47D), 54.12 µM (MCF-7), 93.39 µM (MDA-231) and 225.9 µM (BT-549) (Fig. 6, Table 5). IC50 values in the combined treatment of zeaxanthin and beta-cryptoxanthin were higher than the concentrations of IC50 administered in single treatments for  T47D, MDA-231 and BT-549 cell lines, except for the MCF-7 cell line in which the combined treatment of these two carotenoids proved to be more effective and the identified IC50 concentration was lower compared to the IC50 identified in single treatments.
 
                           
Fig.6 Efectele Zeaxantinei și Beta-criptoxantinei administrate în tratament combinat asupra celor 4 linii celulare de cancer de sân
The rffects of the combined treatment of Zeaxanthin and Beta-Cryptoxanthin on the 4 breast cancer cell lines

Tabelul 5. Citotoxicitatea tratamentului combinat de Zeaxantină și Beta-criptoxantină asupra celor 4 linii celulare standardizate de cancer de sân
Table 5 Cytotoxicity of Zeaxanthin and Beta-Cryptoxanthin Combination Treatment on the 4 Standardized Breast Cancer Cell Lines

Evaluarea efectului chemopreventiv/Evaluation of the chemopreventive effect 

Prin evaluarea efectului chemopreventiv al extractului lipofil de cătină prin metoda DCFDA (2′,7′-diclorodihidrofluorescein diacetat) s-a demonstrat că extractul lipofil de cătină (1-20 µM) a scăzut semnificativ (p=0.0079) procentele de ROS generate de tratamentul cu doxorubicină în cazul tuturor liniilor celulare de cancer de sân testate. (Fig.7).

By evaluating the chemopreventive effect of the lipophilic sea buckthorn extract by the DCFDA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate) method, it was demonstrated that the lipophilic sea buckthorn extract (1-20 µM) significantly decreased (p=0.0079) the percentages of ROS generated by the treatment with doxorubicin in all breast cancer cell lines tested.  (Fig.7).


Fig.7 Efectul tratamentului combinat de doxorubicină cu extract lipofil de catină asupra producției și acumulării ROS în liniile celulare standardizate de cancer de sân la 24 de ore. Pentru fiecare linie celulară, procentul ROS a fost calculat în raport cu controlul.
The effect of combined treatment of doxorubicin with lipophilic sea buckthorn extract on ROS production and accumulation in standardized breast cancer cell lines at 24 hours. For each cell line, the percentage of ROS was calculated relative to the control.


A.4.4 Evaluarea eficacității carotenoizilor β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină și β-criptoxantină + zeaxantină încapsulați în lipozomi comparativ cu liniile celulare tratate cu lipozomii martor cu ajutorul testului MTT
A.4.4 Evaluation of the efficacy of β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic sea buckthorn extract and β-cryptoxanthin + zeaxanthin carotenoids encapsulated in liposomes compared to cell lines treated with control liposomes using MTT test 

Tratamentele cu zeaxantină și beta-criptoxantină încapsulate în lipozomi s-au dovedit a fi mai eficiente comparativ cu tratamentele efectuate cu carotenoide neîncapsulate în lipozomi deoarece concentrația de IC50 pentru linia celulară MDA-231 a scăzut aproximativ la jumătate IC50 Zeaxantină=49.65 µM respectiv IC50 Beta-criptoxantină=26.03 µM comparativ cu concentrațiile IC50 de carotenoide neîncapsulate identificate pentru linia celulară MDA-231 IC50 Zeaxantină=80.05 µM respectiv IC50 Beta-criptoxantină=113 µM (Fig.8, Tabelul 6).

Liposome-encapsulated zeaxanthin and beta-cryptoxanthin treatments have been shown to be more effective compared to unencapsulated carotenoid treatments because the IC50 concentration for the MDA-231 cell line has been reduced by about half following IC50 Zeaxanthin = 49.50 µM respectively Beta-cryptoxanthin = 26.03 µM compared to the IC50 concentrations of non-encapsulated carotenoids identified for the cell line MDA-231 following IC50 Zeaxanthin = 80.05 µM respectively IC50 Beta-cryptoxanthin = 113 µM (Fig.8, Table 6).

Tabelul 6. Citotoxicitatea tratamentului cu Zeaxantină și Beta-criptoxantină încapsulate în lipozomi asupra liniei celulare MDA-231
Table 6 Cytotoxicity of treatment with Zeaxanthin and Beta-cryptoxanthin encapsulated in liposomes on the MDA-231 cell line



Fig.8 Morfologia comparativă a liniei celulare MDA-231 netratată şi tratată cu lipozomi încapsulați cu zeaxantină și β-criptoxantină imortalizată utilizând microscopia cu inversie, magnificaţie 10X
Comparative morphology of untreated and treated MDA-231 cell line with encapsulated zeaxanthin and β-cryptoxanthin into liposomes and immortalized using 10X magnification inversion microscopy


A.4.5 Evaluarea ratei de apoptoză prin marcarea cu Anexină V-FITC și iodură de propidiu și
sortarea celulelor apoptotice într-un citometru de flux S3e Cell Sorter (Bio-Rad) la tratamentele singulare (β-criptoxantină, zeaxantină, extract lipofil de cătină) și combinatorii (β-criptoxantină + zeaxantină, β-criptoxantină + doxorubicină, β-criptoxantină + taxotere, zeaxantină + doxorubicină, zeaxantină + taxotere, extract de cătină + doxorubicină, extract de cătină + taxotere)

A.4.5 Assessment of the apoptosis rate by labeling with Annexin V-FITC and propidium iodide and apoptotic cells sorting  in a S3e Cell Sorter (Bio-Rad) flow cytometer for single (β-cryptoxanthin, zeaxanthin, lipophilic sea buckthorn extract) and combinatorial treatments (β-cryptoxanthin + zeaxanthin, β-cryptoxanthin + doxorubicin, + taxotere, zeaxanthin + doxorubicin, zeaxanthin + taxotere, sea buckthorn extract + doxorubicin, sea buckthorn extract + taxotere)

Tratamentele timp de 4 ore cu carotenoide au indus atât apoptoza timpurie cât și cea târzie, însă procente mai mari de celule apoptotice s-au înregistrat pentru apoptoza târzie. Astfel, ratele de apoptoză târzie obținute în urma tratamentului cu extractul lipofil de cătină sunt: 13.89% (T47D), 30.95% (MCF-7), 14.84% (MDA-231), 16.47 % (BT-549), cele obținute în urma tratamentului cu zeaxantină sunt 16.52% (T47D), 19.78% (MCF-7), 7.73% (MDA-231), 7.77% (BT-549), iar tratamentul cu beta-criptoxantină a determinat un procent de 23.98% (T47D), 17.50% (MCF-7), 5.40% (MDA-231) și 8.30% (BT-549) de celule apoptotice. Ratele de apoptoză timpurie obținite pentru tratamentul cu extract lipofil de cătină sunt următoarele: 0.70% (T47D), 4.52% (MCF-7), 3.58% (MDA-231), 23.15% (BT-549). Tratamentul cu zeaxantină a indus următoarele procente de apoptoză timpurie după cum urmează: 0.60% (T47D0, 1.54% (MCF-7), 0.64% (MDA-231), 6.61% (BT-549), în timp ce tratamentul cu β-criptoxantină a produs o rată de apoptoză timpurie de 0.92% (T47D), 0.97% (MCF-7), 2.80% (MDA-231) și 7.91% (BT-549) (Tabelul 7). În pictogramele obținute cu ajutorul soft-ului FACS DIVA regăsite în Fig.10, se observă o separare clară a populațiilor celulare și se poate concluziona prin faptul că apoptoza celulară în cazul celulelor tratate cu zeaxantină, beta-criptoxantină și extract lipofil de cătină se manifestă mai intens după o creștere a timpului de tratament. În Fig.9 se poate observa o creștere semnificativă a numărului corpilor apoptotici formați după 4 ore de tratament cu doxorubicină, zeaxantină, beta-criptoxantină și extract lipofil de cătină.

The 4 hour carotenoid treatments induced both early and late apoptosis, but higher percentages of apoptotic cells were recorded for late apoptosis. Thus, the rates of late apoptosis obtained after treatment with sea buckthorn lipophilic extract are: 13.89% (T47D), 30.95% (MCF-7), 14.84% (MDA-231), 16.47% (BT-549), those obtained in following treatment with zeaxanthin were 16.52% (T47D), 19.78% (MCF-7), 7.73% (MDA-231), 7.77% (BT-549), and beta-cryptoxanthin treatment resulted in a percentage of 23.98% (T47D). ), 17.50% (MCF-7), 5.40% (MDA-231) and 8.30% (BT-549) of apoptotic cells. The rates of early apoptosis obtained for the treatment with sea buckthorn lipophilic extract are as follows: 0.70% (T47D), 4.52% (MCF-7), 3.58% (MDA-231), 23.15% (BT-549). Zeaxanthin treatment induced the following percentages of early apoptosis as follows: 0.60% (T47D0, 1.54% (MCF-7), 0.64% (MDA-231), 6.61% (BT-549), while treatment with β- Cryptoxanthin produced an early apoptosis rate of 0.92% (T47D), 0.97% (MCF-7), 2.80% (MDA-231) and 7.91% (BT-549) (Table 7).  In Fig. 10 obtained by FACS DIVA software it is reprezented a clear separation of cell populations is observed and it can be concluded that cell apoptosis in cells treated with zeaxanthin, beta-cryptoxanthin and sea buckthorn extract is more intense after an increase in time. Fig. 9 shows a significant increase in the number of apoptotic bodies formed after 4 hours of treatment with doxorubicin, zeaxanthin, beta-cryptoxanthin and sea buckthorn lipophilic extract.



Fig.9 Morfologia comparativă a liniilor celulare T47D, MCF-7, MDA-231 și BT-594 netratate și tratate cu doxorubicină, zeaxantină, beta-criptoxantină și extract lipofil de cătină, magnificaţie 40X (săgeţile roşii indică prezenţa celulelor apoptotice)
Comparative morphology of T47D, MCF-7, MDA-231 and BT-594 cell lines untreated and treated with doxorubicin, zeaxanthin, beta-cryptoxanthin and sea buckthorn extract, magnification 40X (red arrows indicate the presence of apoptotic cells)


Fig.10 Efectul extractului lipofil de cătină, a zeaxantinei și a β-criptoxantinei asupra apoptozei în cadrul celor 4 linii celulare de cancer de sân marcate cu anexină V-FITC și iodură de propidiu (PI). Celulele viabile (non apoptotice) sunt negative pentru anexină V-FITC și PI (stânga jos), celulele pozitive pentru anexină V-FITC și negative pentru PI sunt în apoptoză timpurie (dreapta jos), iar celulele pozitive pentru anexină V-FITC și PI sunt în apoptoză târzie (dreapta sus)
The effect of lipophilic sea buckthorn extract , zeaxanthin and β-cryptoxanthin on apoptosis in the 4 breast cancer cell lines marked with annexin V-FITC and propidium iodide (PI). Viable (non-apoptotic) cells are V-FITC and PI annexin negative (lower left), V-FITC annexin-positive and PI-negative cells are in early apoptosis (lower right), and V-FITC and PI-positive annexin-positive cells are in late apoptosis (top right)

Tabelul 7. Valorile ratei de apoptoză exprimate ca procente cu ajutorul flow-citometrului S3e Cell Sorter (Bio-Rad)
Table 7. Apoptosis rate values expressed as a percentage using the S3e Cell Sorter flow cytometer (Bio-Rad)
 
REZULTATE ETAPA 3 O5. Analiza de tip microarray. O6. Validarea datelor de microarray prin testul de qRT-PCR

RESULTS OF STAGE 3 O5. Microarray analysis. O6. Validation of the microarray data through qRT-PCR assay

A.5.1 Sinteza sondelor de microarray marcate cu cianina 3 (ARNC-Cy3) și hibridizarea acestora pe lame de tipul 3v14944 k Whole Human Genome Oligo Microarray 

A.5.1 Synthesis of cyanine 3-labeled microarray probes (ARNC-Cy3) and hybridization to 3v14944 k Whole Human Genome Oligo Microarray slides 

O concentrație finală de 200 ng de ARN total din fiacare probă s-a utilizat pentru sinteza sondelor de microarray cu un singur fluorocrom (ARNc-Cy3) cu ajutorul kit-ului Low Input Quick Amp labeling (Agilent), conform recomandărilor producătorului. Sondele astfel sintetizate au fost purificate cu ajutorul coloanelor din kit-ul RNeasy mini kit (Qiagen) în conformitate cu recomandările oferite de către producător. S-a efectuat controlul cantitativ al ARNc-Cy3 cu ajutorul spectrofotometrului Nanodrop ND-1000 (Fig 10. Tabelul 8). Hibridarea probelor s-a făcut pe lame Agilent Whole human genome (WHG) de tipul 4x44k cu ajutorul kit-ului Hi-RPM Gene Expression Hybridization.

A final concentration of 200 ng of total RNA from each sample was used to synthesize single-fluorochrome microarray probes (cRNA-Cy3) using the Low Input Quick Amp labeling kit (Agilent) according to the manufacturer's recommendations. Thus, the synthesized probes were purified using the columns of the RNeasy mini kit (Qiagen) according to the recommendations provided by the manufacturer. Quantitative control of cRNA-Cy3 was performed using the Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Fig.10, Table 8). The samples were hybridized on Agilent Whole human genome (WHG) 4x44k slides using the Hi-RPM Gene Expression Hybridization kit.

Fig. 10 Spectrele de absorbție ale sondelor de microarray marcate cu cianină 3 (ARNc-Cy3) măsurate cu NanoDrop-ul ND-1000
Absorption spectra of total RNAs isolated from BT-549 breast cancer cell line measured with NanoDrop ND-1000

Tabelul 8 Cantitățile și activitățile probelor de ARNc-Cy3
Table 8 Quantities and activities of cRNA-Cy3 samples


A.5.2 Scanarea lamelor de microarray cu ajutorul scaner-ului Agilent Technologies G2505B US45102867, procesarea imaginilor cu software-ul Feature Extraction v. 10.5.3 (Agilent Technologies) și analiza datelor cu ajutorul software-ul GeneSpring

A.5.2 Scanning microarray slides using Agilent Technologies G2505B scanner US45102867, image processing with Feature Extraction v. 10.5.3 (Agilent Technologies) software and data analysis using GeneSpring software

Intensitatea fluorescenței celor 44.000 de spoturi de pe fiecare lamă a fost cuantificată cu ajutorul scanner-ului Agilent Technologies G2505B US45102867 prin care s-au general imagini în format tiff care au fost analizate cantitativ cu ajutorul software-ului Feature Extraction v. 10.5.3 (Agilent Technologies) (Fig. 11).

The fluorescence intensity of the 44,000 spots on each slide was quantified using the Agilent Technologies G2505B US45102867 scanner which captured tiff format images that were quantitatively analyzed using Feature Extraction software v. 10.5.3 ( Agilent Technologies) (Fig. 11).

Fig. 11 Imagine de ansamblu a lamei de microarray 4x44k
Fig. 11 Overview of the 4x44k microarray slide

Prin clusterizarea ierarhică rezultată în urma analizei de microarray s-a evidențiat faptul că prin combinarea extractului lipofil de catină cu doxorubicina se produc mai multe modificări la nivel translațional în linia BT-549 decât la tratamentul cu extract de cătină, iar tratamentul cu doxorubicină produce cele mai multe modificări translaționale (Fig.12).

Through the hierarchical clustering as a result from the microarray analysis, it was highlighted that by combining the lipophilic sea buckthorn extract with doxorubicin, more changes are produced at the translational level in the BT-549 line than when treated with sea buckthorn extract, and the treatment with doxorubicin induced the majority of the translational modifications (Fig.12).
Fig.12. Clusterizare ierarhică a probelor luate în studiu. Măsurarea similarităţii a fost făcută pe baza distanţelor euclidiene, iar ca metodă de grupare a clusterelor a fost folosită metoda ward. Se constată formarea a patru clustere distincte corespunzătoare tratamentului cu doxorubicină (DOXO), cu extract lipofil de cătină (CAT) și cu extract lipofil de cătină combinat cu doxorubicină (CATDOXO), precum și liniei celulare BT-549 netratată (CTR).
Hierarchical clustering of the samples taken in the study. Similarity was measured based on Euclidean distances, and the ward method was used as a cluster grouping method. The formation of four distinct clusters corresponding to treatment with doxorubicin (DOXO), lipophilic sea buckthorn extract (CAT) and lipophilic sea buckthorn extract combined with doxorubicin (CATDOXO) and untreated BT-549 cell line (CTR) is observed.

Analiza diferențială a evidentiat că tratamentul cu extractul lipofil de cătină a indus modificarea de cel puțin 1.5 ori a nivelului de expresie a 399 secvențe, ducând la subexprimarea a 111 gene și supraexprimarea a 219 gene (Tabelul 9). Combinarea extractului de cătină cu doxorubicina a modulat profilul transcripțional a 2932 secvențe (prag minim FR ±1.5), dintre care 1147 gene subexprimate, 1324 gene supraexprimate și 461 secvențe necaracterizate, în timp ce doxorubicina a dus la scăderi ale nivelurilor de expresie a 3777 de gene și creșteri ale nivelurilor de expresie a 3675 de gene, inducând modificări și asupra unui număr mare de secvențe necaracterizate (Tabel 9).

Differential analysis revealed that treatment with the lipophilic sea buckthorn extract induced at least a 1.5-fold change in the expression level of 399 sequences, resulting in the underexpression of 111 genes and the overexpression of 219 genes (Table 9). The combination of sea buckthorn extract with doxorubicin modulated the transcriptional profile of 2932 sequences (minimum threshold FR ±1.5), of which 1147 underexpressed genes, 1324 overexpressed genes and 461 uncharacterized sequences, while doxorubicin led to decreases in the expression levels of 3777 genes and increases in the expression levels of 3675 genes, also inducing changes in a large number of uncharacterized sequences (Table 9).

Tabelul 9. Secvențe/gene diferit exprimate de cel puțin 1.5 (p ajustat < 0.05) induse de tratamentul cu extract lipofil de cătină și/sau doxorubicină, în linia celulară BT-549.
Table 9.  Sequences/gene at least 1.5 differentially expressed (adjusted p < 0.05) induced by treatment with lipophilic sea buckthorn  extract and/or doxorubicin in the BT-549 cell line.


Extractul de cătină a dus la subexprimarea de peste 3 ori a doar 2 gene, cu niveluri de expresie de -3.04 și -4.13 și supraexprimarea a 8 cu niveluri de expresie variind între 3.35 și 10.84, în timp ce tratamentul cu doxorubicină a indus scăderea de 3 până la 30.78 ori a nivelurilor de expresie a 798 de gene și cresterea de 3 până la 49 de ori a 336 de gene. Asocierea catină-doxorubicină a determinat o scădere atât a numărului de gene modulate cât și a amplitudinii acestor modulări în comparație cu doxorubicina (39 gene subexprimate într-un interval de variație de -3.04 până la -8.06 și 85 gene supraexprimate de 3 până la 22.99 ori) (Fig. 13, Tabelul 10).

Sea buckthorn extract led to more than 3-fold underexpression of only 2 genes, with expression levels of -3.04 and -4.13, and overexpression of 8 with expression levels ranging from 3.35 to 10.84, while doxorubicin treatment induced the decrease of 3 to 30.78-fold expression levels of 798 genes and 3- to 49-fold increase of 336 genes. The sea buckthorn-doxorubicin treatment caused a decrease in both the number of modulated genes and the amplitude of these modulations compared to doxorubicin (39 genes down-expressed in a range of variation from -3.04 to -8.06 and 85 genes over-expressed from 3 to 22.99 times) (Fig. 13, Table 10).

Fig.13. Numărul genelor sub- și supraexprimate în cazul tratamentului cu extract lipofil de cătina și/sau doxorubicină, în funcție de diferite praguri ale nivelurilor de expresie
Number of under- and over-expressed genes after treatment with lipophilic sea buckthorn extract and/or doxorubicin, according to different thresholds of expression levels

Tabelul 10. Top 10 gene sub- și supraexprimate în linia celulara BT-549 tratată cu extract lipofil de cătina și/sau doxorubicină comparativ cu linia celulară BT-549 netratată.
Table 10. Top 10 under- and over-expressed genes in BT-549 cell line treated with sea buckthorn lipophilic extract and/or doxorubicin compared to untreated BT-549 cell line.

Evaluând profilele transcripționale induse în linia BT-549 de fiecare dintre cele 3 tratamente, au fost identificate seturi de gene unic modulate de acestea. Astfel, 75 de gene (0.9%) au fost unic modulate de extractul de cătină, 11.6% de tratamentul cu catină-doxorubicină, în timp ce majoritatea genelor (68.3%) cu expresie diferențială indusă de doxorubicină au fost unic modulate de aceasta (Fig. 14).

By evaluating the transcriptional profiles induced in the BT-549 line by each of the 3 treatments, sets of genes uniquely modulated by them were identified. Thus, 75 genes (0.9%) were uniquely modulated by sea buckthorn extract, 11.6% by sea buckthorn-doxorubicin treatment, while most genes (68.3%) with differential expression were uniquely modulated by doxorubicin (Fig. 14).
Fig.14. Diagrama Venn pentru genele diferit exprimate în cele 3 comparații CAT vs. CTR, CATDOXO vs. CTR., DOXO vs. CTR
Venn diagram for differentially expressed genes in the 3 CAT vs. CTR, CATDOXO vs. CTR., DOXO vs. CTR

Un număr de 89 de gene au fost comune între toate comparațiile (Figura 14), lista acestora și direcția de modulare în cazul fiecărui tratament fiind prezentate în tabelul 11. Dintre aceste gene, majoritatea au fost identic modulate (fie subexprimate, fie supraexprimate) de fiecare dintre cele 3 tratamente. Analizând setul de gene comune, dar diferit modulate de cele 3 tratamente, se constată că doxorubicina induce majoritar subexpresia acestora, în timp ce cătina induce majoritar supraexpresia lor, în timp ce asocierea cătinei cu doxorubicina duce preponderent la o expresie opusă față de cea observată doar în cazul tratamentului cu doxorubicină (Tabelul 11).

A number of 89 genes were common between all comparisons (Figure 14), their list and the direction of modulation in the case of each treatment being shown in table 11. Among these genes, most were identically modulated (either underexpressed or overexpressed) by each of the 3 treatments. Analyzing the set of common genes, but differently modulated by the 3 treatments, it was found that doxorubicin mostly induced underexpression, while sea buckthorn mostly induced overexpression, while the association of sea buckthorn with doxorubicin mainly leads to an expression opposite to that observed only in the case of doxorubicin treatment (Table 11).

Tabelul 11. Gene comune modulate de cătină și/sau doxorubicină.
Table 11. Common genes modulated by sea buchthorn and/or doxorubicin.

În cazul tratamentului cu extract de cătină, analiza GSEA a evidențiat o îmbogățire semnificativă a 12 seturi de gene la un FDR (False Discovery Rate) <25%, tratamentul cu cătină și doxorubicină a indus modificări la nivelul a 89 de procese biologice și căi moleculare (FDR<25%), în timp ce doxorubicina a indus modificări semnificative a 146 de seturi de gene din colecțiile H și C6 (Tabelul 12). Rezultatele au arătat că toate cele trei tratamente modulează următoarele procese și căi moleculare: HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB, HALLMARK_HYPOXIA, MEK_UP.V1_UP, STK33_UP, ERBB2_UP.V1_UP, în timp ce doar cătina modulează NFE2L2.V2 și CSR_LATE_UP.V1_DN.

In the case of sea buckthorn treatment, the GSEA analysis revealed a significant enrichment of 12 gene sets at a FDR (False Discovery Rate) <25%, sea buckthorn and doxorubicin treatment induced changes in 89 biological processes and molecular pathways (FDR<25%), while doxorubicin induced significant changes in 146 gene sets in the H and C6 collections (Table 12). The results showed that all three treatments modulate the following molecular processes and pathways: HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB, HALLMARK_HYPOXIA, MEK_UP.V1_UP, STK33_UP, ERBB2_UP.V1_UP, while only sea buckthorn modulates NFE2L2.V2 and CSR_LATE_UP.V1_DN.

Tabelul 12. Procese biologice și căi moleculare modulate de tratamentul cu extract de catină și/sau doxorubicină în linia BT-549.


A.6.1  Sinteza de ADN complementar (ADNc), efectuarea testului de real-time PCR cantitativ (qRT-PCR) și analiza statistică a genelor diferit exprimate

A.6.1  Synthesis of complementary DNA (cDNA), quantitative real-time PCR (qRT-PCR) test and statistical analysis of differently expressed genes

Pentru izolarea ARN-ului total, celulele BT-549 (ER-, PR-, HER2-) au fost crescute într-un număr de 350 000 per godeu în plăci cu 6 godeuri (TPP, Elveția) în 2 ml mediu de cultură RPMI 1640/godeu, suplimentat cu 10% ser fetal bovin, glutamină 1% si penicilină-streptomicină 1%, 0,2% insulină la 37°C într-un incubator cu CO2 5%. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu următoarele concentrații de compuși: 4 µM extract lipofil de cătină, 2,5 µM doxorubicină, extract lipofil de cătină+doxorubicină și celule control netratate. Celulele au fost incubate timp de 24 de ore cu tratament, după care acestea au fost lizate în 800 µl TRI Reagent® Solution (Ambion, Thermo Fisher Scientific) şi procesate pentru extracţia ARN-ului total prin metoda clasică cu fenol-cloroform. Pentru acest experiment s-au folosit 4 replicate biologice. ARN-urile totale izolate au fost evaluate din punct de vedere cantitativ cu spectrofotometrul NanoDrop ND-1000 (Tabelul 13, Fig. 15) şi calitativ cu Bioanalizorul Agilent 2100 (Fig. 16).

For total RNA isolation, 350 000 per well BT-549 cells (ER-, PR-, HER2-) were in 6-well plates (TPP, Switzerland) in 2 ml RPMI-1640 culture medium/well, supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% glutamine and 1% penicillin-streptomycin, 0.2% insulin at 37°C in a 5% CO2 incubator. After 24 hours, cells were treated with the following concentrations of compounds: 4 µM lipophilic sea buckthorn extract, 2.5 µM doxorubicin, lipophilic sea buckthorn extract+doxorubicin and untreated control cells. Cells were incubated for 24 hours with treatment, after which they were lysed in 800 µl TRI Reagent® Solution (Ambion, Thermo Fisher Scientific) and processed for total RNA extraction by the classic phenol-chloroform method. For this experiment, 4 biological replicates were used. The isolated total RNAs were evaluated quantitatively with the NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Table 13 , Fig. 15) and qualitatively with the Agilent 2100 Bioanalyzer (Fig 16).

Tabelul 13. Concentraţiile şi calitatea ARN-urilor extrase din linia celulară BT-549 de cancer de sân
Table 13. Concentrations of the extracted RNAs from BT-549 breast cancer cell line
Fig.15. Spectrele de absorpție ale ARN-urilor totale izolate din linia celulară BT-549 de cancer de sân măsurate cu NanoDrop-ului ND-1000
Absorption spectra of total RNAs isolated from BT-549 breast cancer cell line measured with NanoDrop ND-1000

Fig. 16. Electroferogramele ARN-urilor totale izolate din linia celulară BT-549 de cancer de sân analizate cu Bioanalizorul Agilent 2100
Electropherograms of total RNAs isolated from the BT-549 breast cancer cell line analyzed with Agilent 2100 Bioanalyzer

Pentru validarea datelor microarray au fost alese gene identic modulate de cele 3 tratamente (GDF15, IL6, PMAIP1) și o genă modulată diferit de acestea (BBC3) (Tabelul 11). Conform distribuției datelor, grupurile au fost comparate cu testul neparametric Kruskal-Wallis, iar analizele post-hoc au fost realizate cu testul Dunn, prin ajustarea pentru testări multiple a valorii p. Deși rezultatele au evidențiat diferențe statistic semnificate pentru toate genele analizate, în comparațiile post-hoc doar supraexpresia IL6 în urma tratamentului cu cătină-doxorubicină a avut semnificație statistică (Tabelul 14). Valori p foarte apropiate de pragul de semnificație au fost obținute și pentru PMAIP1 în CATDOXO vs. CTR (p=0.0525) și BBC3 în CAT vs. CTR (p=0.0525). În general, analiza qRT-PCR a evidențiat același profil de expresie ca în microarray, excepție făcând GDF15 și PMAIP1 în DOXO vs. CTR, unde aceste gene au fost subexprimate, contrar datelor microarray. (Tabelul 14, Tabelul 11).

For the validation of the microarray data, 3 genes modulated identically by all 3 treatments (GDF15, IL6, PMAIP1) and one gene modulated differently (BBC3) were chosen (Table 11). According to the distribution of the data, the groups were compared with the non-parametric Kruskal-Wallis test, and the post-hoc analyzes were performed with the Dunn test, adjusting for multiple testing of the p-value. Although the results revealed statistically significant differences for all the analyzed genes, in the comparisons post hoc only IL6 overexpression following sea buckthorn-doxorubicin treatment had statistical significance (Table 14). p-values very close to the significance threshold were also obtained for PMAIP1 in CATDOXO vs. CTR (p=0.0525) and BBC3 in CAT vs. CTR (p=0.0525). Overall, qRT-PCR analysis revealed the same expression profile as in the microarray, with the exception of GDF15 and PMAIP1 in DOXO vs. CTR, where these genes were underexpressed, contrary to the microarray data. (Table 14, Table 11).

Tabelul 14. Gene comune identic și diferit modulate de cătină și/sau doxorubicină validate prin testul qRT-PCR.
Table 14. Common genes, identically and differently modulated by sea buckthorn and/or doxorubicin validated by qRT-PCR assay.